översikt
16S rRNA står för 16S ribosomal ribonukleinsyra (rRNA), där s (Svedberg) är en måttenhet (sedimenteringshastighet). Denna rRNA är en viktig beståndsdel i den lilla subenheten (SSU) av prokaryota ribosomer samt mitokondrier och kloroplaster. Figur 1 visar hur 16S rRNA (kort 16S) är involverad i en prokaryotisk ribosom.
dnasegment kodning för rRNA kallas antingen rRNA gen eller rDNA., För sekvensering erhålls sekvensinformation från 16S-genen eftersom DNA är mycket lättare att bearbeta och sekvensera än RNA.
varför 16S rRNA valdes som DNA-streckkodsmolekyl för taxonomi och ekologi
- för att användas som en DNA-streckkod bör en gen ha följande egenskaper.
det bör vara allestädes närvarande. Annars kan vi inte inkludera alla organismer. Alla medlemmar av bakterier och Archaea är kända för att ha 16S gen. - den ska innehålla tillräcklig fylogenetisk information. 16S är ca 1500 bp lång, vilket inte är för kort eller lång.,
- den genetiska variationen inom 16S-genen som finns bland prokaryoter är tillräcklig för att användas i den fylogenetiska analysen för de breda taxonomiska områdena. Det används framgångsrikt för att härleda fylogenetisk relation bland phyla samtidigt som den används i jämförelsen mellan arter i samma släkt.
- Det ska enkelt förstärkas av PCR. 16S genen har flera bevarade regioner som kan användas som priming platser. Detta blir en betydande fördel för NGS-baserade kort läs sekvensering.,
- efter många års internationellt samarbete har vi 16S sequence database som håller nästan alla kända arter av bakterier och Archaea. Genom att söka 16S sekvens mot dessa databaser, vem som helst, även utan kunskap om allvarlig taxonomi, kan identifiera nyligen isolerade stammar.
Variabla regioner med 16S och PCR-primers för att förstärka dem
Sekvensvariation mellan bakteriella 16S är känd för att inte vara jämnt fördelad. Nio hypervariabla regioner identifierades bland bakterier, som heter V1 till V9.,TTCCTTTRAGTTT
The full-length 16S gene is usually amplified by the pair of primers 27F and 1492R, followed by Sanger DNA sequencing., För att erhålla exakt sekvens bör båda DNA-strängarna sekvenseras med hjälp av flera primrar som anges i ovanstående tabell.
tillämpning av NGS till bakteriell samhällsanalys
NGS är rätt för att belysa bakteriell samhällsstruktur, eftersom det eliminerar kravet på tråkig E. coli kloning och tillåter hög genomströmning DNA-sekvensering. Eftersom olika längder av DNA sekvenseras av olika NGS-plattformar, bör ett lämpligt par PCR-primers användas., Tre typer av NGS-sekvensering är möjliga:
- Single-end-sekvensering: DNA-sekvensinformation erhålls från endast en ände av PCR-ampliconen. Roche 454, Ion Torrents
- parat-end-sekvensering: DNA-sekvensinformation erhålls från båda ändarna av PCR-amplikonet. Två sekvenser bör överlappas av en tillräcklignätlängd för att kombinera för att bli en enda sekvens. Illumina
- cirkulär konsensus sekvensering( cca): Pacific Biosciences SMRT-teknik ger mycket lång enda molekyl läser allt >10K bp., På grund av det cirkulära formade biblioteket som används kan samma 16S amplicon sekvenseras flera gånger för att producera exakt konsensussekvens.