Introducere
Una dintre cele mai importantdiscoveries în domeniul de microscopie de fluorescenta a fost găsit într-o meduză în 1960. Osamu Shimomura de la Universitatea Princeton a fost studiat Aequorea victoria, o bioluminiscente meduze., Acesta ar trebui să benoted aici că luminescență nu este la fel ca fluorescenta:
- Luminescență: spontană și emisie de lumină de o substanță (atunci când această substanță este un animal, este numit bioluminiscență)
- Fluorescenta: emisie de lumină de la o substanță care a absorbit lumina și devine excitat
Prin studiul de A. victoria, două proteine majore au fost descoperite: aequorin (o photoprotein), și proteina fluorescentă verde (GFP). Meduza produce calciu, care interacționează cu aequorina și produce luminiscență albastră., Această lumină albastră este absorbită de GFP și re-emisă ca fluorescență verde. Aceste proteine au fost izolate și purificate din meduze și sunt folosite foarte mult în cercetare până în prezent. Pentru această cercetare, Osamu Shimomura și colegii săi au câștigat Premiul Nobel pentru Chimie în 2008.GFP este excitat de lumină în porțiunea albastră/violetă/ultravioletă a spectrului și emite lumină în porțiunea verde (de unde și numele). Structura proteinei poate fi văzută în Fig.1., GFP este o formă de butoi cu porțiunea fluorescentă (cromoforul) formată din doar trei aminoacizi. Când acest cromofor absoarbe lumina albastră, emite fluorescență verde.
![](https://www.photometrics.com/wp-content/uploads/2020/02/GFP-structure.png)
GFP În Cercetare
utilizarea pentru GFP în cercetare devenit clar odată gena GFP a fost, de asemenea, izolate și GFP ar putea fi adăugate la celule sau genetic altoite în organisme vii. Unele aplicații și avantaje ale GFP discutate mai jos.GFP ca marker de toxicitate: datorită faptului că GFP scade intensitatea fluorescenței cu creșterea toxicității, poate fi utilizat ca marker pentru toxicitatea mediului., GFP poate fi adăugat la organismele gazdă fără efect negativ, iar apoi intensitatea urmărită în diferite medii în diferite organisme.GFP este ereditar, dacă un organism are GFP bătut în genomul său, GFP va fi transmis în mod natural pe descendenți fără alte procese suplimentare, permițând modalități neinvazive de introducere a unui marker fluorescent și de urmărire a acestuia de-a lungul generațiilor de animale sau celule. GFP nu interferează cu niciun proces biologic., Șoarecii transgenici pot fi etichetați cu GFP, care este apoi ușor de observat la descendenții lor doar prin expunerea lor la lumină albastră sau UV, așa cum se vede în Fig.2.
![](https://www.photometrics.com/wp-content/uploads/2020/02/GFP-mice.png)
GFP poate fi fuzionat cu alte proteine, făcând în mod eficient aceste proteine fluorescente. Acest lucru se poate face cu linkeri speciali, astfel încât GFP să nu afecteze funcția proteinei de interes și poate difuza în continuare prin celule. Acest lucru permite ca orice proteină să fie localizată și urmărită folosind microscopie fluorescentă standard, strălucind o lumină albastră asupra celulelor, proteina de interes va fluoresce înapoi cu o lumină verde.,GFP în experimentele cu celule vii: molecula fluorescentă verde clasică este izotiocianatul de fluoresceină (FITC), dar aceasta este toxică pentru celule și nu poate fi utilizată direct fără a fixa mai întâi celulele sau a provoca daune inevitabile. GFP este mult mai puțin dăunătoare, deoarece este o proteină naturală și poate fi utilizată în experimente pe celule vii, în timp ce nu provoacă practic nici un prejudiciu, mai ales dacă este transmisă puilor.GFP în aplicații avansate de microscopie., Mai multe aplicații microscopie de fluorescenta, cum ar fi fluorescența de recuperare după fotooxidare (FRAP) și Förster resonance energy transfer (FRET) au fost dezvoltate cu GFP, permițând cercetătorilor să folosească tot mai specifice și aplicații puternice de fluorescență pentru imagistica. Aceste tehnici sunt descrise în alte articole scurte, și anume ce este FRET și ce este FRAP?
GFP este modificabil, deoarece codul genetic și aminoacid pentru GFP este bine înțeles că a fost supus mai multor modificări., În primul rând, GFP a fost modificat pentru a produce GFP îmbunătățit (eGFP), care a crescut intensitatea fluorescenței, fotostabilitatea mai mare, vârfurile de excitație mai convenabile și eficiența mai mare la temperatura camerei. Modificările direct la chromophore permit GFP să fluoresce cu diferite culori, creând albastru (BFP), cyan (CFP), galben (YFP), roșu (RFP) și altele, toate acestea au fost îmbunătățite separat și au propriile aplicații. Unele modificări remarcabile includ mCherry (roșu), citrin și Venus (galben) și Cerulean (cyan) pentru a numi câteva., Familii întregi de proteine fluorescente există acum, toate derivate din GFP original, așa cum se vede în Fig.3.
rezumat
GFP este o parte fundamentală a microscopiei fluorescente datorită ușurinței utilizării și aplicațiilor fiind limitate doar de imaginația cercetătorului. Îmbunătățirile constante ale GFP de-a lungul timpului au determinat microscopia fluorescentă și cercetarea să avanseze, datorită naturii extrem de flexibile a GFP și a corpului mare de cercetare bazat pe utilizarea GFP și a numeroaselor sale variante.