Prezentare generală
16S ARNr reprezintă acidul ribonucleic ribozomal 16S (ARNr), unde s (Svedberg) este o unitate de măsură (rata de sedimentare). Acest ARNr este un constituent important al subunității mici (SSU) a ribozomilor procarioți, precum și a mitocondriilor și cloroplastelor. Figura 1 prezintă modul în care ARNr 16S (în scurt timp 16S) este implicat într-un ribozom procariot.
DNAsegment codificare pentru rRNA este numit fie gena rRNA sau ADNR., În scopul secvențierii, informațiile de secvență sunt obținute de la gena 16S, deoarece ADN-ul este mult mai ușor de procesat și de secvență decât ARN.
De ce 16S rRNA a fost ales ca moleculă de cod de bare ADN pentru taxonomie și Ecologie
- Pentru a fi utilizat ca cod de bare ADN, o genă ar trebui să aibă următoarele caracteristici.
ar trebui să fie prezent omniprezent. În caz contrar, nu putem include toate organismele. Toți membrii de bacterii și Archaea sunt cunoscute de a avea gena 16S. - ar trebui să conțină suficiente informații filogenetice. 16S este de aproximativ 1.500 bp lung, care nu este prea scurt sau lung.,
- variația genetică în cadrul genei 16S găsită printre procariote este adecvată pentru a fi utilizată în analiza filogenetică pentru intervalele taxonomice largi. Este folosit cu succes pentru a deduce relația filogenetică între phyla în timp ce, de asemenea, utilizat în comparație între speciile din același gen.
- ar trebui să fie ușor amplificat prin PCR. Gena 16S are mai multe regiuni conservate care pot fi utilizate ca site-uri de amorsare. Acest lucru devine un avantaj semnificativ pentru secvențierea scurtă de citire bazată pe NGS.,
- după mulți ani de colaborare internațională, avem 16S baza de date secvență care deține aproape toate speciile cunoscute de bacterii și arhaea. Prin căutarea secvenței 16S în aceste baze de date, oricine, chiar și fără cunoștințe de taxonomie gravă, poate identifica tulpini nou izolate.
regiuni variabile de 16S și primeri PCR pentru a le amplifica
variația secvenței între 16S bacteriene este cunoscută a nu fi distribuită uniform. Nouă regiuni hipervariabile au fost identificate printre bacterii, care sunt numite V1 la V9.,TTCCTTTRAGTTT
The full-length 16S gene is usually amplified by the pair of primers 27F and 1492R, followed by Sanger DNA sequencing., Pentru a obține o secvență exactă, ambele fire de ADN trebuie secvențiate folosind mai mulți primeri dați în tabelul de mai sus.NGS este potrivit pentru elucidarea structurii comunității bacteriene, deoarece elimină cerința clonării obositoare A E. coli și permite secvențierea ADN cu randament ridicat. Deoarece diferite lungimi de ADN sunt secvențiate de diferite platforme NGS, trebuie utilizată o pereche adecvată de primeri PCR., Sunt posibile trei tipuri de secvențiere NGS:
- secvențiere cu un singur capăt: informațiile despre secvența ADN sunt obținute de la un singur capăt al AMPLICONULUI PCR. Roche 454, torentele Ionice
- secvențiere la capătul pereche: informațiile despre secvența ADN sunt obținute de la ambele capete ale AMPLICONULUI PCR. Două secvențe ar trebui să fie suprapuse de o lungime suficientă pentru a se combina pentru a deveni o singură secvență. Illumina
- Circular consensus sequencing( cca): tehnologia SMRT Pacific Biosciences oferă o singură moleculă foarte lungă care citește >10K bp., Datorită bibliotecii în formă circulară utilizată, același amplicon 16S poate fi secvențiat de mai multe ori pentru a produce o secvență de consens precisă.