visão geral
16S rRNA representa 16S ácido ribonucleico ribosomal (rRNA), sendo S (Svedberg) uma unidade de medida (taxa de sedimentação). Este rRNA é um importante componente da pequena subunidade (SSU) dos ribossomas procarióticos, bem como mitocôndrias e cloroplastos. A figura 1 mostra como o 16S rRNA (em breve 16S) está envolvido em um ribossoma procariótico.
dnasegment coding for rRNA is called either rRNA gene or rDNA., Para fins de sequenciamento, a informação de sequência é obtida a partir do gene 16S, porque o DNA é muito mais fácil de processar e sequência do que o RNA.
Why 16S rRNA was chosen as DNA barcode molecule for taxonomy and ecology
- To be used as a DNA barcode, a gene should have the following characteristics.deve estar ubiquitamente presente. Caso contrário, não podemos incluir todos os organismos. Todos os membros de bactérias e Archaea são conhecidos por ter o gene 16S.deve conter informação filogenética suficiente. 16S tem cerca de 1.500 bp de comprimento, o que não é muito curto ou longo.,
- a variação genética dentro do gene 16S encontrada entre os procariontes é adequada para ser usada na análise filogenética para as amplas gamas taxonômicas. É usado com sucesso para inferir a relação filogenética entre os filos, enquanto também é usado na comparação entre espécies do mesmo gênero.deve ser facilmente amplificado por PCR. O gene 16S tem várias regiões conservadas que podem ser usadas como locais de preparação. Isso se torna uma vantagem significativa para a sequenciação de Leitura curta baseada em NGS.,após muitos anos de colaboração internacional, temos uma base de dados de sequência 16S que contém quase todas as espécies conhecidas de bactérias e Archaea. Ao pesquisar a sequência 16S contra estas bases de Dados, qualquer pessoa, mesmo sem conhecimento de taxonomia séria, pode identificar estirpes recém-isoladas.
regiões variáveis de 16S e iniciadores PCR para amplificá-los
ariação de sequência entre 16S bacterianos é conhecido por não ser uniformemente distribuído. Nove regiões hipervariáveis foram identificadas entre as bactérias, que são chamadas V1 a V9.,TTCCTTTRAGTTT
The full-length 16S gene is usually amplified by the pair of primers 27F and 1492R, followed by Sanger DNA sequencing., Para obter uma sequência precisa, ambas as cadeias de ADN devem ser sequenciadas utilizando vários iniciadores indicados na tabela acima.
a aplicação de NGS à análise comunitária bacteriana
NGS é correcta para elucidar a estrutura comunitária bacteriana, uma vez que elimina a exigência de clonagem tediosa de E. coli e permite a sequenciação de ADN de alto rendimento. Uma vez que diferentes comprimentos de DNA são sequenciados por várias plataformas NGS, um par adequado de iniciadores PCR deve ser usado., Três tipos de sequenciamento NGS são possíveis:
- sequenciação de Fim único: a informação de sequência de DNA é obtida a partir de apenas uma extremidade do amplificador PCR. Roche 454, torrentes de iões
- sequenciação emparelhada: a informação da sequência de ADN é obtida em ambas as extremidades do fragmento amplificado de PCR. Duas sequências devem ser sobrepostas por um comprimento de sufixo para se combinarem para se tornarem uma única sequência. Illumina
- sequenciação de consenso Circular( cca): a tecnologia SMRT de Biociências do Pacífico fornece uma molécula muito longa que varia >10K BP., Por causa da biblioteca em forma circular usada, o mesmo amplificador 16S pode ser sequenciado várias vezes para produzir uma sequência de consenso precisa.