wprowadzenie
jedna z najważniejszych odkryć w dziedzinie mikroskopii fluorescencyjnej została znaleziona w Meduzie w latach 60. Osamu Shimomura z Uniwersytetu Princeton badała Aequorea victoria, bioluminescencyjną meduzę., Należy tu zaznaczyć, że luminescencja nie jest tym samym co fluorescencja:
- luminescencja: spontaniczna emisja światła z substancji (gdy substancja ta jest zwierzęciem, nazywa się ją bioluminescencją)
- Fluorescencja: emisja światła z substancji, która pochłonęła światło i staje się podekscytowana
dzięki badaniu A. victoria odkryto dwa główne białka: aequorin (fotoproteina) i zielone białko fluorescencyjne (GFP). Meduza wytwarza wapń, który wchodzi w interakcję z aequoriną i wytwarza niebieską luminescencję., To niebieskie światło jest absorbowane przez GFP i ponownie emitowane jako zielona fluorescencja. Białka te zostały wyizolowane i oczyszczone z meduz i są intensywnie wykorzystywane w badaniach do dnia dzisiejszego. Za te badania Osamu Shimomura i współpracownicy otrzymali Nagrodę Nobla w dziedzinie chemii w 2008 roku.
zielone białko fluorescencyjne
GFP jest wzbudzany przez światło w niebieskiej / fioletowej / ultrafioletowej części widma i emituje światło w zielonej części (stąd nazwa). Strukturę białka można zobaczyć na Rys.1., GFP ma kształt beczki z fluorescencyjną częścią (chromoforem) składającą się z zaledwie trzech aminokwasów. Kiedy ten chromofor pochłania niebieskie światło, emituje zieloną fluorescencję.
![](https://www.photometrics.com/wp-content/uploads/2020/02/GFP-structure.png)
GFP w badaniach
zastosowanie GFP w badaniach stało się jasne, gdy gen GFP został również wyizolowany i GFP może zostać dodany do komórek lub genetycznie zaszczepiony w żywe organizmy. Niektóre zastosowania i zalety GFP omówione poniżej.
GFP jako marker toksyczności: ze względu na fakt, że GFP zmniejsza intensywność fluorescencji wraz ze wzrostem toksyczności, może być stosowany jako marker toksyczności środowiskowej., GFP może być dodawany do organizmów żywicielskich bez negatywnego wpływu, a następnie intensywność śledzona w różnych środowiskach w różnych organizmach.
GFP jest dziedziczny, jeśli organizm ma GFP zapukany do swojego genomu, GFP będzie naturalnie przekazywane na potomstwo bez żadnych dodatkowych procesów, pozwalając na nieinwazyjne sposoby wprowadzenia znacznika fluorescencyjnego i śledzenia go przez pokolenia zwierząt lub komórek. GFP nie zakłóca żadnych procesów biologicznych., Transgeniczne myszy mogą być oznaczone GFP, który jest następnie łatwo zaobserwować u ich potomstwa tylko przez wystawienie ich na światło niebieskie lub UV, jak widać na Rys.2.
![](https://www.photometrics.com/wp-content/uploads/2020/02/GFP-mice.png)
GFP może być łączony z innymi białkami, skutecznie czyniąc te białka fluorescencyjnymi. Można to zrobić za pomocą specjalnych linkerów, aby GFP nie wpływał na funkcję interesującego białka i nadal może rozprzestrzeniać się przez komórki. Pozwala to na lokalizację białka i śledzenie za pomocą standardowej mikroskopii fluorescencyjnej, świecąc niebieskim światłem na komórkach, białko zainteresowania będzie fluoresce powrotem z zielonym światłem.,
GFP w eksperymentach z żywymi komórkami: klasyczną zieloną cząsteczką fluorescencyjną jest izotiocyjanian fluoresceiny (FITC), ale jest to toksyczne dla komórek i nie może być stosowane bezpośrednio bez uprzedniego mocowania komórek lub powodowania nieuniknionych uszkodzeń. GFP jest znacznie mniej szkodliwe, ponieważ jest naturalnie występującym białkiem i może być stosowany w eksperymentach na żywych komórkach, nie powodując praktycznie żadnych uszkodzeń, zwłaszcza jeśli jest przekazywany potomstwu.
GFP w zaawansowanych zastosowaniach mikroskopii., Kilka fluorescenci mikroskopia zastosowania tak jak fluorescenci odzysk po photobleaching (FRAP) i Förster resonance energy transfer (FRET) rozwijali z GFP, pozwalający naukowcom używać coraz bardziej specyficzni i potężni zastosowania fluorescencja dla ich zobrazowanie. Techniki te są opisane w innych krótkich artykułach, mianowicie co to jest FRET i CO TO JEST FRAP?
GFP jest modyfikowalny, ponieważ kod genetyczny i aminokwasowy dla GFP jest dobrze zrozumiany, został poddany kilku modyfikacjom., Po pierwsze GFP został zmodyfikowany w celu uzyskania ulepszonego GFP (eGFP), który ma zwiększoną intensywność fluorescencji, większą fotostabilność, wygodniejsze piki wzbudzenia i wyższą wydajność w temperaturze pokojowej. Modyfikacje bezpośrednio do chromoforu pozwalają na GFP fluoresce z różnych kolorów, tworząc niebieski( BFP), cyan (CFP), żółty( YFP), czerwony (RFP) i inne, z których wszystkie zostały ulepszone na oddzielnie i mają swoje własne zastosowania. Niektóre wyróżniające się modyfikacje obejmują mCherry (czerwony), cytryn i Wenus (żółty) i Cerulean (cyjan), aby wymienić tylko kilka., Obecnie istnieją całe rodziny fluorescencyjnych białek, wszystkie pochodzące z oryginalnego GFP, jak widać na Rys.3.
podsumowanie
GFP jest podstawową częścią mikroskopii fluorescencyjnej ze względu na łatwość użycia i zastosowania ograniczone tylko wyobraźnią badacza. Ciągłe ulepszenia na GFP w czasie spowodowały mikroskopii fluorescencyjnej i badań do przodu, ze względu na bardzo elastyczny charakter GFP i duży korpus badań opartych na użyciu GFP i jego wiele wariantów.