Inleiding
een van de belangrijksteontdekkingen op het gebied van de fluorescentiemicroscopie werd in de jaren zestig gevonden bij een kwal. Osamu Shimomura van Princeton University bestudeerde Aequorea victoria, een bioluminescente kwal., Hier moet worden opgemerkt dat luminescentie niet hetzelfde is als fluorescentie:
- luminescentie: de spontane emissie van licht van een stof (als die stof een dier is, wordt het bioluminescentie genoemd)
- fluorescentie: de emissie van licht van een stof die licht heeft geabsorbeerd en opgewonden wordt
door de studie van A. victoria werden twee belangrijke eiwitten ontdekt: aequorine (een fotoproteïne) en groen fluorescerend eiwit (GFP). De kwal produceert calcium, dat in wisselwerking staat met aequorine en blauwe luminescentie produceert., Dit blauwe licht wordt geabsorbeerd door GFP en opnieuw uitgezonden als groene fluorescentie. Deze proteã nen zijn geà soleerd en gezuiverd van de kwallen en worden tot op de dag van vandaag zwaar in onderzoek gebruikt. Voor dit onderzoek wonnen Osamu Shimomura en zijn collega ‘ s in 2008 de Nobelprijs voor de Scheikunde.
groen fluorescerend eiwit
GFP wordt opgewekt door licht in het blauw/violet/ultraviolet gedeelte van het spectrum en zendt licht uit in het groene gedeelte (vandaar de naam). De structuur van het eiwit is te zien in Fig.1., GFP is een vatvorm met het fluorescente gedeelte (chromophore) samengesteld uit enkel drie aminozuren. Wanneer deze chromophore blauw licht absorbeert, zendt het groene fluorescentie uit.
![](https://www.photometrics.com/wp-content/uploads/2020/02/GFP-structure.png)
GFP in onderzoek
het gebruik voor GFP in onderzoek werd duidelijk toen het gen voor GFP ook werd geïsoleerd en GFP kon worden toegevoegd aan cellen of genetisch geënt in levende organismen. Sommige toepassingen en voordelen van GFP hieronder besproken.
GFP als toxiciteitsmarker: vanwege het feit dat GFP de fluorescentieintensiteit afneemt met toenemende toxiciteit, Kan het worden gebruikt als een marker voor milieutoxiciteit., GFP kan aan gastheerorganismen zonder negatief effect worden toegevoegd, en dan de intensiteit die door verschillende milieu ‘ s in diverse organismen wordt gevolgd.
GFP is erfelijk, als een organisme GFP geklopt-in aan zijn genoom heeft, zal GFP natuurlijk op nakomelingen zonder extra processen worden doorgegeven, die voor niet-invasieve manieren toestaan om een fluorescente teller te introduceren en het over generaties van dieren of cellen te volgen. GFP interfereert niet met biologische processen., De transgene muizen kunnen met GFP worden geëtiketteerd, die dan gemakkelijk in hun nakomelingen wordt waargenomen enkel door hen aan blauw of UVlicht bloot te stellen, zoals gezien in Fig.2.
![](https://www.photometrics.com/wp-content/uploads/2020/02/GFP-mice.png)
GFP kan worden gefuseerd met andere eiwitten, waardoor deze eiwitten effectief fluorescerend worden. Dit kan met speciale linkers worden gedaan zodat GFP de functie van de proteã ne van belang niet beà nvloedt, en het kan nog door cellen verspreiden. Dit staat om het even welke proteã ne toe om worden gelokaliseerd en gevolgd gebruikend standaard fluorescente microscopie, door een blauw licht op de cellen te schijnen, zal de proteã ne van belang terug met een groen licht fluoresceren.,
GFP in experimenten met levende cellen: het klassieke groene fluorescerende molecuul is fluoresceïne – isothiocyanaat (FITC), maar dit is giftig voor cellen en kan niet direct worden gebruikt zonder eerst de cellen te fixeren of onvermijdelijke schade te veroorzaken. GFP is veel minder schadelijk aangezien het een natuurlijk-voorkomende proteã ne is en in experimenten op levende cellen kan worden gebruikt terwijl het veroorzaken vrijwel geen schade, vooral als het aan nakomelingen wordt doorgegeven.
GFP in geavanceerde microscopie toepassingen., Verscheidene toepassingen van de fluorescentiemicroscopie zoals fluorescentieterugwinning na het photobleaching (FRAP) en de overdracht van de försterresonantieenergie (lijstwerk) werden ontwikkeld met GFP, toestaand voor onderzoekers om steeds specifiekere en krachtige toepassingen van fluorescentie voor hun weergave te gebruiken. Deze technieken worden beschreven in andere korte artikelen, namelijk wat is FRET en wat is FRAP?
GFP is modificeerbaar, aangezien de genetische en aminozuurcode voor GFP goed begrepen is het onderworpen aan verscheidene wijzigingen is geweest., Ten eerste werd GFP gewijzigd om verbeterde GFP (eGFP) te veroorzaken, die fluorescentieintensiteit, Grotere photostability, geschiktere opwindingspieken en hogere efficiency bij kamertemperatuur heeft verhoogd. De wijzigingen direct aan chromophore staan voor GFP toe om met verschillende kleuren te fluoresceren, die tot blauw (BFP), cyaan (GVB), geel (YFP), rood (RFP) en anderen leiden, die elk afzonderlijk zijn verbeterd en hun eigen toepassingen hebben. Sommige opvallende wijzigingen omvatten mCherry (rood), Citrien en Venus (geel), en Cerulean (cyaan) om er een paar te noemen., De volledige families van fluorescente proteã nen bestaan nu, allen die uit origineel GFP worden afgeleid, zoals gezien in Fig.3.
samenvatting
GFP is een fundamenteel onderdeel van de fluorescentiemicroscopie vanwege het gebruiksgemak en de toepassingen die alleen door de verbeelding van de onderzoeker worden beperkt. De constante verbeteringen van GFP na verloop van tijd hebben fluorescentiemicroscopie en onderzoek veroorzaakt om zich vooruit te bewegen, wegens de hoogst flexibele aard van GFP en het grote lichaam van onderzoek dat op het gebruiken van GFP en zijn vele varianten wordt gebaseerd.