Oversikt
16S rRNA står for 16S ribosom ribonucleic acid (rRNA), der S (Svedberg) er en måleenhet (senkningsreaksjon). Dette rRNA er en viktig bestanddel av small subunit (SSU) av prokaryotic ribosomes samt mitokondrier og chloroplasts. Figur 1 viser hvordan 16S rRNA (kort tid 16S) er involvert i en prokaryotic ribosomet.
DNAsegment koder for rRNA kalles enten rRNA-genet eller rDNA., For det formål å sekvensering, sekvens opplysningene er innhentet fra 16S gen fordi DNA er mye enklere å behandle og rekkefølge enn RNA.
Hvorfor 16S rRNA ble valgt som DNA-strekkode-molekylet for artskunnskap og økologi
- for Å bli brukt som en DNA-strekkode, et gen bør ha følgende egenskaper.
Det bør være ubiquitously til stede. Vi kan ellers ikke inkluderer alle organismer. Alle medlemmer av Bakterier og Archaea er kjent for å ha 16S-genet. - Det bør inneholde tilstrekkelig fylogenetisk informasjon. 16S er rundt 1500 bp lang, noe som ikke er for kort eller lang.,
- Den genetiske variasjonen innen 16S genet funnet blant prokaryotes er tilstrekkelig til å bli brukt i fylogenetisk analyse for de brede taksonomisk områder. Det er med hell brukt til å utlede fylogenetisk forhold blant phyla mens også brukt i sammenligningen mellom arter i samme slekt.
- Det bør være lett forsterket ved PCR. 16S genet har flere konserverte regioner som kan brukes som grunning nettsteder. Dette blir en betydelig fordel for NGS-baserte kort lese-sekvensering.,
- Etter mange år med internasjonalt samarbeid, vi har 16S sekvens database holder nesten alle kjente arter av Bakterier og Archaea. Ved å søke 16S sekvens mot disse databasene, hvem som helst, selv uten kunnskap om alvorlige taksonomi, kan identifisere nylig isolerte stammer.
Variable regioner av 16S og PCR-primere til å forsterke dem på
Sekvens variasjon blant bakterielle 16S er kjent for å være ikke jevnt fordelt. Ni hypervariable områder ble identifisert blant Bakterier, som er oppkalt V1 til V9.,TTCCTTTRAGTTT
The full-length 16S gene is usually amplified by the pair of primers 27F and 1492R, followed by Sanger DNA sequencing., For å få nøyaktige sekvensen, både DNA-tråder som bør være sekvensert ved hjelp av flere primere som er gitt i tabellen ovenfor.
Anvendelse av NGS bakteriell samfunnet analyse
NGS er riktig for elucidating bakteriell samfunnsstruktur, som det eliminerer krav kjedelig E. coli kloning og gir høy gjennomstrømning DNA-sekvensering. Fordi ulike lengder av DNA er sekvensert av ulike NGS-plattformer, en passende par av PCR-primere som bør brukes., Tre typer av NGS-sekvensering er mulig:
- Enkelt-end-sekvensering: DNA-sekvens opplysningene er innhentet fra bare den ene enden av PCR-amplikon. Roche 454, – Ion-Torrents
- Koblede-end-sekvensering: DNA-sekvens opplysningene er innhentet fra begge ender av PCR-amplikon. To sekvenser bør være overlappes av en sufficnet lengde for å kombinere for å bli en enkelt sekvens. Illumina
- Sirkulær konsensus sekvensering (cca): Pacific Biovitenskap’ SMRT teknologi som gir svært lang enkelt molekyl leser alt >10K bp., På grunn av den runde-formet-biblioteket som brukes, den samme 16S-amplikon kan bli sekvensert flere ganger for å produsere nøyaktige konsensus rekkefølge.