Bevezetés
a fluoreszkáló mikroszkópia területén az egyik legfontosabb felfedezést egy medúzában találták megaz 1960-as években. Osamu Shimomura a Princeton Egyetemen tanulmányozta Aequorea victoria, egy biolumineszcens medúza., Meg kell benoted itt, hogy a lumineszcencia nem ugyanaz, mint a fluoreszcencia:
- Lumineszcencia: a spontán emisszió a fény egy anyag (ha ez az anyag egy állat, úgy nevezett biolumineszcencia jelensége)
- Fluoreszcens: a kibocsátott fény egy anyag, amely az elnyelt fény válik izgatott
Keresztül a tanulmány A. victoria, két fő fehérjét fedeztek fel: aequorin (egy photoprotein), zöld fluoreszcens protein (GFP). A medúza kalciumot termel, amely kölcsönhatásba lép az aequorinnal, és kék lumineszcenciát termel., Ezt a kék fényt a GFP elnyeli, és zöld fluoreszcenciaként újra kibocsátja. Ezeket a fehérjéket izolálták és megtisztították a medúzától, és a mai napig erősen használják a kutatásban. A kutatásért Osamu Shimomura és kollégái 2008-ban kémiai Nobel-díjat nyertek.
zöld fluoreszkáló fehérje
a GFP-t a spektrum kék/lila/ultraibolya részében lévő fény izgatja, és fényt bocsát ki a zöld részen (innen a név). A fehérje szerkezete az ábrán látható.1., A GFP egy hordó alakú, a fluoreszkáló rész (a kromofor) mindössze három aminosavból áll. Amikor ez a kromofor elnyeli a kék fényt, zöld fluoreszcenciát bocsát ki.
GFP A Kutatás
A használja a GFP a kutatás egyértelművé vált, miután a gén a GFP is elszigetelt GFP lehet hozzá, hogy a sejtek, vagy genetikailag oltott élő szervezetekre. A GFP egyes alkalmazásait és előnyeit az alábbiakban tárgyaljuk.
GFP mint toxicitási marker: mivel a GFP a fluoreszcencia intenzitásának növekedésével csökken a toxicitás növekedésével, a környezeti toxicitás markereként használható., A GFP hozzáadható a negatív hatás nélküli gazdaszervezetekhez, majd a különböző organizmusok különböző környezeteiben nyomon követhető intenzitással.
a GFP öröklődő, ha egy szervezetnek GFP-je van a genomjába, a GFP természetesen további folyamatok nélkül kerül az utódokra, lehetővé téve a nem invazív módszereket fluoreszkáló marker bevezetésére és nyomon követésére az állatok vagy sejtek generációi között. A GFP nem zavarja a biológiai folyamatokat., A transzgenikus egereket GFP-vel lehet címkézni, amelyet utódaikban könnyen megfigyelhetnek, csak kék vagy UV fénynek kitéve, amint az az ábrán látható.2.
GFP lehet fuzionált más fehérjék, hatékonyan, hogy ezek a fehérjék fluoreszkáló. Ezt speciális linkerekkel lehet megtenni, így a GFP nem befolyásolja az érdeklődő fehérje működését, és még mindig diffúz a sejteken keresztül. Ez lehetővé teszi, hogy bármely fehérje lokalizálható és nyomon követhető legyen standard fluoreszkáló mikroszkóppal, kék fény ragyogásával a sejteken, az érdekes fehérje zöld fényben fluoreszkál.,
GFP élő sejtes kísérletekben: a klasszikus zöld fluoreszcens molekula fluoreszcein izotiocianát( FITC), de ez mérgező a sejtekre, és nem használható közvetlenül a sejtek első rögzítése vagy elkerülhetetlen károsodás nélkül. A GFP sokkal kevésbé káros, mivel természetes eredetű fehérje, és használható élő sejteken végzett kísérletekben, miközben gyakorlatilag nem okoz kárt, különösen akkor, ha az utódokra kerül.
GFP fejlett mikroszkópos alkalmazásokban., Számos fluoreszcens mikroszkópos alkalmazást fejlesztettek ki, mint például a fluoreszcencia visszanyerése a fotobleaching (FRAP) és a Förster resonance energy transfer (FRET) után, lehetővé téve a kutatók számára, hogy képalkotásukhoz egyre specifikusabb és erősebb fluoreszcencia alkalmazásokat használjanak. Ezeket a technikákat más rövid cikkek írják le, nevezetesen mi a FRET és mi a FRAP?
a GFP módosítható, mivel a GFP genetikai és aminosav-kódja jól ismert, hogy több módosításnak is alávetették., Először a GFP-t úgy módosították, hogy továbbfejlesztett GFP (eGFP) legyen, amely növeli a fluoreszcencia intenzitását, nagyobb fotostabilitást, kényelmesebb gerjesztési csúcsokat és nagyobb hatékonyságot eredményez szobahőmérsékleten. A közvetlenül a kromofórra történő módosítások lehetővé teszik, hogy a GFP különböző színekkel fluoreszkáljon, kék (BFP), Cián (CFP), sárga (YFP), piros (RFP) és mások, amelyek mindegyike külön-külön javult, és saját alkalmazásokkal rendelkezik. Egyes kiemelkedő módosítások közé tartozik a mCherry (piros), a citrin és a Vénusz (sárga), valamint a Cerulean (Cián), hogy néhányat említsünk., A fluoreszkáló fehérjék egész családjai léteznek, mindegyik az eredeti GFP-ből származik, amint az az ábrán látható.3.
összefoglaló
a GFP a fluoreszcencia mikroszkópia alapvető része a könnyű használat miatt, és az alkalmazásokat csak a kutató képzelete korlátozza. A GFP idővel történő folyamatos javulása miatt a fluoreszcens mikroszkópia és a kutatás előrehaladt, köszönhetően a GFP rendkívül rugalmas jellegének és a GFP és annak számos változata alapján végzett nagy kutatásnak.