Indledning
En af de mest importantdiscoveries inden for fluorescerende mikroskopi blev fundet i en vandmand i 1960’erne. Osamu Shimomura Princeton University studerede Aequorea victoria, en selvlysende vandmænd., Det bør benoted her, at luminescens er ikke det samme som fluorescens:
- Luminescens: spontan emission af lys fra et stof (når stoffet er et dyr, er det betegnes bioluminescens)
- Fluorescens: emission af lys fra et stof, der har absorberet lys og bliver ophidset
Gennem studiet af A. victoria, to store proteiner, der blev opdaget: aequorin (en photoprotein), og grønne fluorescerende protein (GFP). Vandmændene producerer calcium, som interagerer med Ae .uorin og producerer blå luminescens., Dette blå lys absorberes af GFP og udsendes igen som grøn fluorescens. Disse proteiner er blevet isoleret og renset fra vandmændene og bruges stærkt i forskning til denne dag. Til denne forskning vandt Osamu Shimomura og kolleger Nobelprisen i kemi i 2008.
Grønne Fluorescerende Protein
GFP er ophidset af lys i den blå/violette/ultraviolette del af spektret og udsender lys i den grønne del (deraf navnet). Proteinets struktur kan ses i fig.1., GFP er en tøndeform med den fluorescerende del (kromoforen) bestående af kun tre aminosyrer. Når denne chromophore absorberer blåt lys, udsender den grøn fluorescens.
![](https://www.photometrics.com/wp-content/uploads/2020/02/GFP-structure.png)
GFP I Forskning
brug for GFP i forskning blev klart, når genet for GFP blev også isoleret og GFP kan være tilføjet til celler eller genetisk podet ind i levende organismer. Nogle applikationer og fordele ved GFP diskuteret nedenfor.
GFP som toksicitetsmarkør: på grund af det faktum, at GFP falder i fluorescensintensitet med stigende toksicitet, kan den bruges som markør for miljøtoksicitet., GFP kan føjes til værtsorganismer uden negativ effekt, og derefter intensiteten spores gennem forskellige miljøer i forskellige organismer.
GFP er arvelige, hvis en organisme har GFP slået-i dens genom, GFP vil naturligvis blive overført til afkommet uden yderligere processer, der giver mulighed for ikke-invasive metoder for at indføre en fluorescerende markør, og spore det hele generationer af dyr eller celler. GFP forstyrrer ikke nogen biologiske processer., Transgene mus kan mærkes med GFP, som derefter let observeres i deres afkom bare ved at udsætte dem for blåt eller UV-lys, som det ses i Fig.2.
![](https://www.photometrics.com/wp-content/uploads/2020/02/GFP-mice.png)
GFP kan smeltes sammen med andre proteiner, hvilket effektivt gør disse proteiner fluorescerende. Dette kan gøres med specielle linkere, så GFP ikke påvirker funktionen af proteinet af interesse, og det kan stadig diffundere gennem celler. Dette gør det muligt at lokalisere og spore ethvert protein ved hjælp af standard fluorescerende mikroskopi, ved at skinne et blåt lys på cellerne, vil proteinet af interesse fluorescere tilbage med et grønt lys.,
GFP i live-celle eksperimenter: det klassiske grønne fluorescerende molekyle er fluoresceinisothiocyanat (FITC), men dette er giftigt for celler og kan ikke bruges direkte uden først at fikse cellerne eller forårsage uundgåelig skade. GFP er langt mindre skadeligt, da det er et naturligt forekommende protein og kan bruges i forsøg på levende celler, mens det næsten ikke forårsager skade, især hvis det overføres til afkom.GFP i avancerede mikroskopi applikationer., Flere fluorescens mikroskopi applikationer som fluorescens recovery efter photobleaching (FRAP) og Förster resonans energi overførsel (FRET) blev udviklet med GFP, der giver mulighed for forskere til at bruge stadig mere specifikke og effektive programmer af fluorescens for deres imaging. Disse teknikker er beskrevet i andre korte artikler, nemlig hvad er FRET og hvad er FRAP?
GFP kan ændres, da den genetiske og aminosyrekode for GFP er godt forstået, har den været genstand for flere ændringer., For det første blev GFP modificeret til at producere forbedret GFP (eGFP), som har øget fluorescensintensitet, større fotostabilitet, mere bekvemme e .citationstoppe og højere effektivitet ved stuetemperatur. Ændringer direkte til chromophore giver GFP mulighed for at fluorescere med forskellige farver, hvilket skaber blå (BFP), cyan (CFP), gul (YFP), rød (RFP) og andre, som alle er blevet forbedret separat og har deres egne applikationer. Nogle standout modifikationer omfatter mCherry (rød), Citrin og Venus (gul) og Cerulean (cyan) for at nævne nogle få., Hele familier af fluorescerende proteiner findes nu, alle afledt af den originale GFP, som det ses i Fig.3.
Oversigt
GFP er en grundlæggende del af fluorescens mikroskopi på grund af brugervenligheden og de applikationer, der kun begrænset af forskerens fantasi. Konstante forbedringer på GFP over tid har forårsaget fluorescens mikroskopi og forskning for at bevæge sig fremad, på grund af de meget fleksible karakter af GFP og den store mængde af forskning, der er baseret på brug af GFP og dens mange varianter.