Úvod
Jeden z nejvíce importantdiscoveries v oblasti fluorescenční mikroskopie bylo zjištěno, v medúzy v roce 1960. Osamu Shimomura z Princetonské Univerzitě studoval Aequorea victoria, bioluminiscenční medúzy., To by benoted tady, že luminiscence není totéž jako fluorescence:
- Luminiscence: spontánní emise světla z látky (při které látka je zvíře, to se nazývá bioluminiscence)
- Fluorescence: emise světla z látky, která absorbuje světlo a stává nadšený
Prostřednictvím studia A. victoria, dva hlavní proteiny byly objeveny: aequorin (photoprotein), a zelený fluorescenční protein (ONZP). Medúza produkuje vápník, který interaguje s aequorinem a vytváří modrou luminiscenci., Toto modré světlo je absorbováno GFP a znovu emitováno jako zelená fluorescence. Tyto proteiny byly izolovány a vyčištěny z medúzy a jsou používány ve výzkumu dodnes. Pro tento výzkum získal Osamu Shimomura a jeho kolegové Nobelovu cenu za chemii v roce 2008.
Zelený Fluorescenční Protein
ONZP je nadšený tím, že světlo v modré/fialové/ultrafialové části spektra a emituje světlo v zelené části (odtud název). Struktura proteinu je vidět na obr.1., GFP je barelový tvar s fluorescenční částí (chromoforem) tvořenou pouze třemi aminokyselinami. Když tento chromofor absorbuje modré světlo, vydává zelenou fluorescenci.
![](https://www.photometrics.com/wp-content/uploads/2020/02/GFP-structure.png)
GFP Ve Výzkumu
použití pro GFP do výzkumu jasné, jakmile se gen pro GFP byl také izolován a GFP může být přidán na buňky nebo geneticky roubované na živé organismy. Některé aplikace a výhody GFP jsou popsány níže.
GFP jako marker toxicity: vzhledem k tomu, že GFP snižuje intenzitu fluorescence se zvyšující se toxicitou, může být použit jako marker environmentální toxicity., GFP může být přidán do hostitelských organismů bez negativního účinku a poté intenzita sledovaná v různých prostředích v různých organismech.
ONZP je dědičné, pokud organismus má ONZP srazil-v jeho genomu, ONZP bude přirozeně být přeneseny na potomstvo bez jakékoli další postupy, umožňující neinvazivní způsoby zavedení fluorescenční značkovací a měřicí to napříč generacemi zvířat nebo buněk. GFP neinterferuje s žádnými biologickými procesy., Transgenní myši mohou být označeny GFP, který je pak snadno pozorován u jejich potomků pouhým vystavením modrému nebo UV světlu, jak je vidět na obr.2.
![](https://www.photometrics.com/wp-content/uploads/2020/02/GFP-mice.png)
GFP mohou být kondenzované s jinými proteiny, účinně dělat ty proteiny, fluorescenční. To lze provést pomocí speciálních linkerů, takže GFP neovlivňuje funkci proteinu, který je předmětem zájmu, a může se stále rozptýlit buňkami. To umožňuje lokalizovat a sledovat jakýkoli protein pomocí standardní fluorescenční mikroskopie, zářícím modrým světlem na buňkách se zajímavý protein fluoreskuje zpět zeleným světlem.,
GFP v živých buněk experimenty: klasické zelené fluorescenční molekula je fluorescein isothiokyanátem (FITC), ale tohle je toxický pro buňky a nemůže být použit přímo, bez první fixace buňky nebo způsobuje nevyhnutelné škody. GFP je daleko méně škodlivé, jako je přirozeně se vyskytující protein a mohou být použity v experimentech na živých buňkách a zároveň působit prakticky žádné škody, zejména pokud je přenesena na potomstvo.
GFP v pokročilých mikroskopických aplikacích., Několik fluorescenční mikroskopie aplikací, jako jsou fluorescence recovery after foto – (FRAP) a Förster resonance energy transfer (FRET) byly vyvinuty s GFP, což umožňuje, aby výzkumníci používají někdy více specifické a výkonné aplikace, fluorescence pro jejich zobrazování. Tyto techniky jsou popsány v jiných krátkých článcích, a to, co je FRET a co je FRAP?
GFP je modifikovatelný, protože genetický a aminokyselinový kód pro GFP je dobře pochopen, že podléhá několika modifikacím., Za prvé GFP byl upraven tak, aby produkovat enhanced GFP (eGFP), který má zvýšenou fluorescenční intenzity, vyšší fotostabilitu, pohodlnější buzení píků a vyšší účinnost při pokojové teplotě. Úpravy přímo na chromofor umožňují ONZP se fluoreskují s různými barvami, vytváří modré (BFP), azurová (SRP), žlutá (YFP), red (RFP) a dalších, z nichž všechny byly vylepšeny samostatně a mají své vlastní aplikace. Některé standout modifikace zahrnují mCherry (červená), Citrin a Venuše (žlutá), a Cerulean (azurová) abychom jmenovali alespoň některé., Nyní existují celé rodiny fluorescenčních proteinů, všechny odvozené od původního GFP,jak je vidět na obr.3.
shrnutí
GFP je základní součástí fluorescenční mikroskopie kvůli snadnému použití a aplikace jsou omezeny pouze představivostí výzkumníka. Neustálé zlepšování GFP v průběhu času způsobilo, že fluorescenční mikroskopie a výzkum se posunuly vpřed díky vysoce flexibilní povaze GFP a velkému výzkumu založenému na použití GFP a jeho mnoha variantách.