Přehled
16S rRNA je zkratka pro 16S ribozomální ribonukleové kyseliny (rRNA), kde S (Svedberg) je jednotka měření (sedimentace). Tato rRNA je důležitou složkou malé podjednotky (SSU) prokaryotických ribozomů, stejně jako mitochondrií a chloroplastů. Obrázek 1 zobrazuje, jak se 16S rRNA (krátce 16S) podílí na prokaryotickém ribozomu.
dnasegment coding for rRNA se nazývá buď Gen rRNA nebo rDNA., Pro účely sekvenování se informace o sekvenci získávají z genu 16S, protože DNA je mnohem snazší zpracovat a sekvenovat než RNA.
proč byl 16S rRNA vybrán jako molekula čárového kódu DNA pro taxonomii a ekologii
- pro použití jako čárový kód DNA by Gen měl mít následující vlastnosti.
mělo by být všudypřítomně přítomno. Jinak nemůžeme zahrnout všechny organismy. Je známo, že všichni členové bakterií a Archaea mají gen 16S. - měl by obsahovat dostatečné fylogenetické informace. 16S je asi 1500 bp dlouhá, což není příliš krátké nebo dlouhé.,
- genetická variace v genu 16S nalezeném mezi prokaryoty je vhodná pro použití ve fylogenetické analýze pro široké taxonomické rozsahy. To je úspěšně používá k odvození fylogenetických vztahů mezi člověkem a zároveň použít pro srovnání mezi druhy ve stejném rodu.
- měl by být snadno zesílen PCR. Gen 16S má více konzervovaných oblastí, které lze použít jako místa primingu. To se stává významnou výhodou pro sekvenování krátkého čtení na bázi NGS.,
- Po mnoho let mezinárodní spolupráce, máme 16 sekvence databáze drží téměř všechny známé druhy Bakterií a Archaea. Prohledáním sekvence 16S proti těmto databázím může kdokoli, i bez znalosti vážné taxonomie, identifikovat nově izolované kmeny.
variabilní oblasti 16S a PCR primery pro jejich zesílení
variace sekvence mezi bakteriálními 16S je známo, že nejsou rovnoměrně distribuovány. Mezi bakteriemi, které se jmenují V1 až V9, bylo identifikováno devět hypervariabilních oblastí.,TTCCTTTRAGTTT
The full-length 16S gene is usually amplified by the pair of primers 27F and 1492R, followed by Sanger DNA sequencing., Pro získání přesné sekvence by měly být oba řetězce DNA sekvenovány pomocí více primerů uvedených ve výše uvedené tabulce.
Aplikace NGS bakteriální společenství analýzy
NGS je pro objasnění bakteriální struktury společenství, jak to odstraňuje požadavek únavné E. coli klonování a umožňuje vysokou propustnost sekvenování DNA. Protože různé délky DNA jsou sekvenovány různými platformami NGS, měl by být použit vhodný pár primerů PCR., Jsou možné tři typy sekvenování NGS:
- jednokoncové sekvenování: informace o sekvenci DNA se získávají pouze z jednoho konce amplikonu PCR. Roche 454, Ion torrenty
- párové sekvenování: informace o sekvenci DNA se získávají z obou konců amplikonu PCR. Dvě sekvence by měly být překryty délkou sufficnet kombinovat, aby se stala jedinou sekvencí. Illumina
- Kruhový konsensu sekvenování (cca): Pacific Biosciences‘ SMRT technologie poskytuje velmi dlouhou jedné molekuly čte v rozmezí >10K bp., Vzhledem k použité knihovně kruhového tvaru může být stejný amplicon 16S sekvenován vícekrát, aby se vytvořila přesná sekvence konsensu.